多糖具有广泛的免疫调节功能和抗肿瘤作用，且无毒副作用或毒副作用较小，是一类很有开发价值的抗肿瘤天然药物。树突状细胞（Dendritic cells, DC）是功能^强大的专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cells, APC），参与抗原的摄取、加工及提呈，是机体免疫反应的始动者，在诱导初次免疫应答过程中具有独特的地位，由于它在机体的抗感染免疫及抗肿瘤免疫应答中的作用极其重要而备受重视，成为近年来免疫学研究的热点。

    黄芪是一种传统的补益类中药，味甘、性温，含有多种生物活性物质，其中黄芪多糖对机体免疫活性的调节功能尤为突出，它能够提高细胞免疫及体液免疫，并对一些细胞因子具有一定的调节作用。

    我国作为中医药学的发源国和中药大国，有着深厚的中药理论基础，开发中药多糖药物具有独特的优势和良好的发展前景。我国传统中药的现代化技术标准体系的建立是中药走向世界的一个重要步骤，也是中药发展所必须解决的一个重要问题。在《中国未来20年技术预见研究》——生物技术领域技术课题中就指出将“采用基因表达指纹图谱、化学成分指纹图谱或生物活性指纹图谱进行新型中药的开发”，所以对中药多糖的免疫调节机制进行研究，建立完整的中药多糖调节机体免疫功能的指标体系是十分重要的。真菌多糖类药物的开发已有了较多的产品，而高等真核类生物多糖类药物的开发却鲜见报道，对它们的作用机制的分析也不够完整。不同的多糖由于其分子结构的不同，其在抗原提呈细胞上的受体和产生的生物学效应也有所不同，研究黄芪多糖不同分子量的组分对DC功能以及抗肿瘤作用的影响，初步揭示DC在黄芪多糖抗肿瘤免疫中所起的作用及其作用机制，不仅具有良好的原创性和学术前沿性，而且为黄芪多糖抗肿瘤药物的开发，开拓国际市场奠定理论基础。浙江省为全国著名的经济大省，具有很强的经济势力，百年老店胡庆馀堂和青春宝集团都是全国著名的中药企业，为浙江省中药事业的发展作出了重大的贡献，并产生良好的社会效益，所以开发黄芪多糖类药物，研究其作用机制，这对浙江中药经济的发展具有一定的推动作用，并将产生较好的经济效益和社会效益。研究和建立黄芪多糖的免疫调节功能的指纹图谱，对其它抗肿瘤多糖类药物的质量标准的制定等都具有重要的意义。

本项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系；

    项目研究目标：阐述黄芪多糖对小鼠骨髓来源DC功能的影响，以及与抗肿瘤免疫的关系；建立黄芪多糖免疫调节功能的指纹图谱。

    申请者长期从事免疫学领域的研究，是浙江省中医药重点学科的主要成员，在中药组分的分离、制备以及免疫功能调节方面进行了多年的研究，并发表了多篇研究论文。项目申请者和项目组的其他成员近年来对一些中药组分（特别是中药多糖）的免疫调节功能进行了较全面的筛选和初步研究，发现了一些组分具有比较特殊的免疫调节功能，黄芪多糖就是其中的一种，该项目的研究成果对其它中药组分的功能研究也具有较好的推动作用。项目组的主要成员为浙江省中医药重点学科的主要成员，主要的工作目标就是通过几年的研究积累，争取获得国家中医药的重点学科。所以本项目研究目标及与申请者研究工作长期目标是一致的。

项目研究内容，研究方案和进度安排

（一）、项目研究内容：

    体外实验研究黄芪多糖与DC的结合情况，研究黄芪多糖对DC的表面分子和细胞因子表达的影响，以及DC表面黄芪多糖的受体及信号转导通路。

    确定不同分子量的黄芪多糖的免疫调节功能的差异及相关的生物活性指纹图谱。

    整体动物实验研究黄芪多糖对小鼠多种免疫指标（细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫和细胞因子分泌）及抗肿瘤活性的关系。

（二）、研究方法、技术路线及实验手段：

    1.小鼠骨髓来源的树突状细胞的培养和纯化：脱臼处死6-8周龄 C57BL/6j(H-2^b)小鼠，颈椎，取出股骨和胫骨，PBS反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，1000-1500转/分钟离心5-10分钟，红细胞裂解液裂解红细胞，用PBS洗三遍后重悬于含30ng/ml GM-CSF 、20ng/ml IL-4以及10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，接种于6孔板，三天后，吸掉未贴壁的细胞、换液。第五天，采用MiniMACS免疫磁性分离系统纯化树突状细胞。

    2.黄芪多糖与DC的结合：用荧光物质2-氨基吖啶酮标记黄芪多糖，在激光共聚焦显微镜下观察黄芪多糖与DC的结合情况；

    3.流式细胞仪分析黄芪多糖对DC表面标志分子表达的影响：收集纯化并经药物处理24 h后的DC，FACS缓冲液（含2％FCS和0.1％叠氮钠的PBS）洗两遍，于4℃下用10％的羊血清封闭细胞表面抗体15分钟，然后加入PE标记的抗MHCⅡ（I-A/I-E）单克隆抗体和FITC标记的抗CD11c单克隆抗体，于4℃下温育30分钟，用FACS缓冲液洗三遍，然后用200μl FACS缓冲液重悬细胞置于流式细胞仪上检测。